VHP灭菌的步骤如下。
①准备工作。将干燥箱冷阱中的水分清除干净，使内部表面干燥，且温度均一，测量搁板、箱壁、冷阱盘管等处温度均在允许范围内（灭菌有效温度为4~80℃），测试冻干机与蒸气发生器间无泄漏，冻干机在真空下能维持一段时间真空度没有明显下降。
②灭菌。将冻干机抽到250Pa以下，将30%的双氧水放入发生器，双氧水在发生器内气化后通入干燥箱和冷阱，维持一定时间后放人无菌空气并排气。这样重复数次。
③灭菌结束后，通人无菌空气，用水环泵将空气排出，直至排气中含双氧水的质量分数在0.0001%以下。若用油封泵则应在泵前加装触媒板，使双氧水分解成水和氧。
④检验。一般采用生物指示剂检查灭菌效果，即用耐热板培养耐热杆菌孢子，每1cm2板上培养105个孢子的冻干品，将其悬挂于拟检验处，箱阱用VHP灭菌后，将其取出放人培养液中培养24小时到7天，检验冻干机该处是否已完全灭菌。
